Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby cd

(Sekwencje starterów stosowanych w reakcji łańcuchowej polimerazy [PCR] są dostępne jako Dodatek Dodatek wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie http://www.nejm.org.) Analizowano produkty amplifikacji PCR (Mutation Detection) Żele wzmacniające z 5 procentowym glicerolem, FMC BioProducts, Rockland, Me.) I sekwencjonowane w razie potrzeby (sekwenser ABI 377, Applied Biosystems, Foster City, CA, i GeneScan Analysis Program, wersja 2.0.2, Applied Biosystems). Próbki genomowego DNA z wzorami przesunięcia według skanowania genowego zastosowano do wytworzenia 521-par zasad odpowiadających domenie głowy keratyny 8 w celu późniejszego sekwencjonowania i trawienia enzymem restrykcyjnym Ncol i EcoT22I. Metody biochemiczne
Próbki tkanek z eksplantowanych wątrób zostały homogenizowane w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem zawierającej 1% n-dodecylo-N, N-dimetyloglicyny (Empigen BB, Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA), EDTA (5 mmol na litr) i inhibitory proteazy . Próbki odwirowano przy 16 000 xg przez 30 minut, a sklarowany supernatant zastosowano do strącania 18. Immunoprecypitaty kompleksu keratynowego 8-keratyny 18 otrzymano z eksplantowanych wątrób z użyciem przeciwciała L2A116 anty-K8-K18, a następnie analizuje się jedną z następujących metod: denaturującą elektroforezę w żelu poliakryloamidowym w warunkach redukujących lub nieredukujących (tj. z lub bez merkaptoetanolu), a następnie barwienie błękitem Coomassie; immunoblot; lub dwuwymiarową analizę żelu (ogniskowanie izoelektryczne w kierunku poziomym i elektroforezę w żelu poliakryloamidowym w kierunku pionowym) 21, a następnie immunoblotting. Ekstrakty otrzymano przez solubilizację transfekowanych komórek buforem Laemmli22 lub przez rozbijanie komórek przez zamrażanie i rozmrażanie, wirowanie (w celu uzyskania frakcji cytosolowej), a następnie solubilizację peletki buforem do próbek. Przeciwciała (Neomarkers, Union City, CA), które są swoiste dla samej keratyny 8 (przeciwciało M20) lub samą keratynę 18 (przeciwciało DC10) zastosowano do immunoblottingu.
Barwienie immunofluorescencyjne
Komórki NIH 3T3 transfekowane DNA kodującym zarówno keratynę 8, jak i keratynę 18 utrwalono w 100 procentach metanolu po ekspozycji na warunki kontrolne, ogrzewanie (42 ° C przez 18 godzin), kwas okadaikowy (1 .g na mililitr na godzinę) lub nadtlenek wodoru. (0, 20 lub 50 mmol na litr na godzinę) przed utrwaleniem (całkowity czas hodowli, 54 godziny). Keratyny wybarwiono najpierw M20, a następnie przeciwciałem przeciw kozim sprzężonym z Texas Red. 16 obrazów uzyskano za pomocą skanera konfokalnego (MRC 1024, Bio-Rad, Hercules, CA) za pomocą mikroskopu (Eclipse TE300, Nikon, Melville, NY). Transfekowane komórki zliczono i podzielono na kategorie, zależnie od rodzaju zawartego w nich włókna keratynowego, jako mające normalne włókna ciągłe, zwinięte włókna ciągłe (widoczne jako okaleczenie okołojądrowe lub grube wiązki) lub zdemontowane włókna (widoczne jako kropki lub krótkie włókna).
Analiza statystyczna
Dokładny test Fishera (dwustronny) 23 wykorzystano do analizy proporcji pacjentów z mutacjami keratyny 8 w grupie z kryptogenną chorobą wątroby w porównaniu z proporcjami tych z mutacjami keratyny 8 w grupie z nie kryptogenną chorobą i w porównaniu z odsetek osób z mutacjami keratyny 8 w grupie losowo wybranych pacjentów (grupa kontrolna)
[podobne: wciągnięta błona bębenkowa, ortodonta gliwice, jak działa aparat ortodontyczny ]
[więcej w: ebola kraków, stulejka kraków, uchyłek żołądka ]