Nonwirusowy transfer genu VIII kodującego czynnik krzepnięcia genu u pacjentów z ciężką hemofilią cd

Fibroblasty skórne wyizolowano do hodowli komórkowej i późniejszej transfekcji plazmidem. Wszyscy pacjenci otrzymali infuzję czynnika VIII przed biopsją w celu zwiększenia poziomu aktywności czynnika VIII w osoczu do 100 procent normy. Czynnik VIII podawano przez dodatkowe trzy lub cztery dni w celu utrzymania prawidłowej hemostazy. Laparoskopia
Około 7 tygodni po biopsji skóry pacjenci wrócili do szpitala w celu wykonania kolejnej oceny klinicznej, którą wykonano dzień przed implantacją komórki. Czynnik VIII podano wlew tuż przed zabiegiem chirurgicznym w celu zwiększenia poziomów aktywności czynnika VIII w osoczu do około 100% normy, a wlewy kontynuowano dwa lub trzy razy dziennie przez jeden tydzień po operacji. Zabieg laparoskopowy wykonano podczas znieczulenia ogólnego. 10-mm trokar został wprowadzony do jamy otrzewnej poprzez nacięcie podsiotłowe za pomocą otwartej techniki. Po wdmuchnięciu dwutlenku węgla w tym miejscu wprowadzono laparoskop. Pod bezpośrednią wizją, pojedynczy, 5-mm operacyjny trokar został wprowadzony do śródbrzusza, a przez ten trokar, laparoskopowy chwytak został użyty do manipulowania większą siecią. 9-centymetrową igłę rdzeniową o średnicy 20 umieszczono bezpośrednio przez ścianę brzuszną pod bezpośrednim kątem widzenia i około 0,5 ml zawiesiny komórek wstrzyknięto przez igłę do większej sieci w każdym z kilku miejsc. Po zabiegu pacjentów obserwowano przez noc w klinicznym ośrodku badawczym. Wszystkich sześciu pacjentów wypisano do domu w pierwszym dniu po operacji.
Oceny kliniczne w domach pacjentów były wykonywane codziennie przez pielęgniarkę prowadzącą badania w dniach od 2 do 6 po operacji. Pacjenci mieli zostać poddani ocenie klinicznej w szpitalu w ciągu tygodni 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 i 18 oraz miesięcy 6, 9 i 12 po wszczepieniu komórek, z dodatkowym monitorowaniem do drugiego roku.
Przygotowanie autologicznych fibroblastów eksprymujących czynnik VIII
Plazmid, który zawierał gen kodujący ludzki czynnik VIII, z którego usunięto domenę B i który zawierał promotor ludzkich fibronektyn, wprowadzono przez elektroporację do fibroblastów skóry, które zostały wyizolowane z próbki z biopsji skóry. Sekwencja kodująca domenę B nie została włączona do plazmidu, ponieważ nie jest wymagana dla koagulacyjnej aktywności czynnika VIII lub oddziaływania czynnika VIII z czynnikiem von Willebranda16, 17; ponadto obecność domeny B zmniejsza ekspresję czynnika VIII w transfekowanych komórkach ssaczych. Fibronektyna, białko macierzy pozakomórkowej, ulega ekspresji w fibroblastach; jego promotor skutecznie kieruje transkrypcją czynnika VIII z delecją domeny B w pierwotnych ludzkich skórnych fibroblastach.
Stabilnie transfekowane klony fibroblastów, które zawierały plazmid zawierający czynnik VIII z delecją domeny B, wybrano w pożywce zawierającej G418, wyizolowano, ekspandowano w pożywce nieselektywnej i scharakteryzowano. Charakterystyka obejmowała pomiar ekspresji czynnika VIII, ocenę właściwości wzrostu komórek (w tym badanie rakotwórczości w tkankach miękkich in vitro), bezpieczeństwo mikrobiologiczne i analizę Southern blot
[więcej w: ortodonta gliwice, ortodonta kościerzyna, zatrucie atropiną ]
[przypisy: katalepsja, iperyt azotowy, metamina ]