olsztyn ul kościuszki 13 ad

Próbki wątroby pobrano podczas operacji we Francji, Włoszech i Japonii oraz podczas autopsji w Afryce Południowej. Nie wykluczono obecności hemochromatozy, choroby Wilsona i chorób autoimmunologicznych oraz niedoboru .1-antytrypsyny. Sześciu pacjentów miało historię przewlekłego nadużywania alkoholu. Leukocyty krwi obwodowej otrzymano od 15 dawców krwi bez markerów serologicznych HBV i stosowano jako próbki kontrolne.
Testy serologiczne
Badanie HBsAg, antygenu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (anty-HBc) i antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (anty-HBs) przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami (test radioimmunologiczny, Abbott Laboratories, North Chicago).
Testowanie PCR
Tabela 1. Tabela 1. Sekwencje oligonukleotydowe stosowane jako startery i sondy HBV (od podtypu HBV4). * Ekstrakcję i amplifikację DNA przeprowadzono jak opisano uprzednio 5, 23, 38; szczególną ostrożność podjęto w celu uniknięcia zanieczyszczenia. Porównując sekwencje nukleotydowe w wirusach hepadna, zdefiniowaliśmy różne zestawy konserwatywnych sekwencji DNA do użycia jako startery i sondy swoiste dla HBV (Tabela 1).
RNA ekstrahowano z 25 do 50 mg zamrożonych próbek guza według metody izotioocyjanianu guanidium-chlorku cezu.41 Próbki o masie od do 3 .g inkubowano z 4 jednostkami dezoksyrybonukleazy wolnej od rybonukleazy (Promega, Biotec, Madison, Wis.) 37 ° C przez 30 minut. Enzym następnie inaktywowano termicznie (w 95 ° C przez 5 minut) i przeprowadzono odwrotną transkrypcję w objętości 20 .l, która zawierała 20 pmoli późniejszego startera, 200 .mol każdego z czterech deoksynukleotydów na litr, 50 mmol TRIS kwasu chlorowodorowego na litr (pH 8,3), 75 mmol chlorku potasu na litr, 10 mmol ditiotreitolu na litr, 3 mmol chlorku magnezu na litr, 2 .g albuminy z surowicy bydlęcej pozbawionej nukleaz i 200 U sklonowanego Moloney odwrotna transkryptaza wirusa mysich białaczek (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD), inkubowano w 42 ° C przez 30 minut. Komplementarny produkt DNA amplifikowano w 100 .l, zawierającego 20 pmol startera poprzedzającego, 200 .mol każdego z czterech deoksynukleotydów na litr i bufor PCR. Wykonano czterdzieści cykli, tak jak w PCR dla DNA. W każdym doświadczeniu i dla każdej próbki przeprowadzono test kontrolny z pominięciem odwrotnej transkryptazy.
Po amplifikacji sekwencji RNA, 14 .l mieszaniny PCR poddano elektroforezie na 1,5% żelu agarozowym w buforze boranowym TRIS i przeniesiono na membranę nylonową (Gene-Screen Plus, NEN, Boston). Filtry poddano prehybrydyzacji i hybrydyzacji w ściśle określonych warunkach, jak opisano wcześniej
Kontrola wrażliwości i swoistości
Wykazano, że testy PCR są bardzo czułe w wykrywaniu DNA HBV. Jesteśmy w stanie wykryć zaledwie fg referencyjnego sklonowanego DNA HBV42. Jednakże ten wysoki poziom czułości może łatwo prowadzić do fałszywie pozytywnych wyników z powodu drobnych zanieczyszczeń. Dlatego podjęto następujące środki ostrożności, aby zapewnić ważność wyników. (1) Środki ostrożności mające na celu uniknięcie przeniesienia produktu PCR obejmowały fizyczne oddzielenie mieszanin przed-PCR i po-PCR oraz podwielokrotności odczynników, stosowanie pipet o dodatnim wyporności i unikanie aerozoli
[więcej w: hiperostoza czołowa, iperyt azotowy, ortodonta kościerzyna ]