olsztyn ul kościuszki 13 czesc 4

Aby potwierdzić wyniki uzyskane dla każdego startera, DNA nowotworu wielokrotnie testowano z wszystkimi pięcioma kombinacjami starterów w tym samym eksperymencie i analizowano w tym samym żelu (Fig. 1). Widoczne były dwa różne wzory (tabela 3). W 6 z 14 guzów (w tym 4 od pacjentów z Afryki Południowej) wyniki były pozytywne przy użyciu wszystkich starterów specyficznych dla regionów kodujących poprzedzających S, S, X i C. W pozostałych 8 guzach wyniki były dodatnie tylko z dwoma, trzema lub czterema z pięciu zestawów starterów (ryc. 1). Rysunek 2. Rysunek 2. Wykrywanie RNA wirusa HBV za pomocą testu PCR. Ścieżki A, B i C przedstawiają RNA HBV wykryty w trzech z czterech guzów. RT + wskazuje, że przed PCR wykonano etap odwrotnej transkryptazy, a RT – tę PCR wykonano bez tego etapu, wykrywając w ten sposób skażenie DNA HBV preparatem nowotworowego RNA. Ścieżka D reprezentuje RNA z normalnej tkanki wątroby stosowanej jako kontrola negatywna. Czas ekspozycji dla górnych autoradiogramów wynosił 2 godziny, a dla autoradiogramów dolnych 22 godziny.
Niski poziom zanieczyszczenia DNA HBV (RT-) stał się widoczny dopiero po 22 godzinach ekspozycji i wyraźnie różni się od dodatnich wyników uzyskanych po etapie odwrotnej transkryptazy.
Dostępnych było pięć guzów do oznaczenia RNA wirusa HBV. Przeprowadzono testy PCR ze starterami swoistymi dla genu S; w czterech z pięciu badanych guzów wyraźnie widać cząsteczki RNA informacyjnego HBV (ryc. 2). Po traktowaniu DNazą I dodatni wynik zaobserwowano tylko wtedy, gdy przeprowadzono odwrotną transkryptazę przed amplifikacją PCR. Procedura ta wykluczyła możliwość, że pozytywne wyniki były spowodowane jedynie zanieczyszczeniem DNA preparatu RNA.
Potencjalne ryzyko fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych wyników w testach PCR zostało wyeliminowane, ponieważ obszerne eksperymenty kontrolne (opisane w sekcji Metody) były wielokrotnie rozstrzygające. Konsekwentne wyniki uzyskano również w niezależnych powtórzeniach ocen ekstraktów z tych samych guzów. Nie uzyskano żadnych pozytywnych wyników w normalnych próbkach wątroby testowanych równolegle lub w 15 próbkach leukocytów krwi obwodowej od dawców krwi negatywnych względem HBV. Nie było dowodów na zanieczyszczenie plazmidowym DNA. Na koniec, wykrycie RNA HBV w czterech z pięciu testowanych guzów dodatkowo potwierdziło nasze wyniki.
Dyskusja
Badanie to wykazuje za pomocą bardzo czułej procedury (PCR) częstą obecność transkrypcyjnie aktywnych genomów HBV w ograniczonej liczbie komórek nowotworowych u pacjentów z ujemnym mianem HBsAg z rakiem wątroby.
Zidentyfikowano dwa różne wzory cząsteczek DNA wirusa HBV. W guzach (6 z 14), dla których pozytywne wyniki uzyskano przy użyciu wszystkich starterów pokrywających różne regiony kodujące HBV, wyniki były zgodne z brakiem dużych delecji w wirusowym DNA. Nie można ustalić stanu DNA HBV (tj. Wolnego lub zintegrowanego) za pomocą testu PCR. Przeciwnie, w guzach (8 z 14), dla których pozytywne wyniki były wielokrotnie uzyskiwane tylko z dwoma, trzema lub czterema z pięciu zestawów starterów testowanych w tym samym eksperymencie, wyniki były zgodne z delecjami w DNA HBV. Mogło to odzwierciedlać obecność wolnych, usuniętych genomów HBV lub integrację wadliwego wirusowego DNA
[hasła pokrewne: aparat ortodontyczny przed i po, jak działa aparat ortodontyczny, metamina ]