Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby ad 7

Przed obróbką transfekowane komórki hodowano w 42 ° C przez 18 godzin (panele A, B i C) i inkubowano przez godzinę w obecności kwasu okadaicznego (1 .g na mililitr) (panele D, E i F) lub nadtlenek wodoru (50 mmol na litr) (panele G, H i I). Naprężenie cieplne i traktowanie kwasem okadaicznym doprowadziło do zapadnięcia się i demontażu znacznej części filamentów keratynowych w komórkach transfekowanych ketatyną Y53H 8 (strzałki w panelach B i E) w porównaniu z komórkami transfekowanymi keratyną 8 typu dzikiego (panele A i D) lub G61C keratyna 8 (panele C i F). Ekspozycja na nadtlenek wodoru spowodowała mniej demontażu włókien (widocznych jako tworzenie kropek) w komórkach transfekowanych ketatyną G61C 8 (panel I) niż w tych transfekowanych keratyną 8 typu dzikiego lub Y53H (strzałki odpowiednio w panelach G i H). Biorąc pod uwagę ugruntowaną cytoochronną rolę keratyn hepatocytów, 4,9, porównaliśmy wpływ stresu komórkowego na reorganizację włókien keratynowych w normalnej keratynie 8 i zmutowanej keratynie 8. Zbadaliśmy naprężenia, które indukują reorganizację włókien keratynowych, w tym ciepła, 25 kwas fosfatazy, inhibitor kwasu okadaikowego, 26-28 i nadtlenek wodoru.29 Białko z mutacją Y53H było związane ze znacznie większą proporcją komórek z niestabilnymi (złożonymi lub zdemontowanymi) włóknami, niż było typu dzikiego lub keratyną G61C 8, gdy komórki były narażone na stres cieplny (20 procent, 56 procent i 28 procent komórek transfekowanych, odpowiednio, dzikiego typu, Y53H i G61C keratyny 8 DNA) lub kwasu okadaicznego (odpowiednio 31 procent, 69 procent i 31 procent) ( P <0,001 dla porównania typu dzikiego lub G61C i Y53H) (Figura 2). Read more „Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby ad 7”

Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby ad 6

Dwóch pacjentów z mutacją G61C miało cechy autoimmunologiczne. Jeden pacjent z historią nadużywania wielu substancji miał mieszane nacieki limfocytów i komórek plazmatycznych w jej próbce z biopsji wątroby i eksplantowanej tkance, chociaż testy serologiczne na autoimmunizację były negatywne i nie miała odpowiedzi na leczenie prednizonem i azatiopryną. Jeden pacjent miał podwyższone przeciwciała przeciwjądrowe (miano, 1: 640) i przeciwciała przeciwko mięśniom gładkim (miano, 1:20), ale jej próbki do biopsji nie zawierały komórek plazmatycznych. Jeden pacjent z mutacją Y53H miał ciała Mallory ego, ale nie miał historii nadużywania alkoholu. Żaden z pacjentów z mutacją w genie keratyny 8 nie miał w przeszłości cukrzycy ani hiperlipidemii. Read more „Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby ad 6”

Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby ad 5

W nieredukujących warunkach ok. 100-kd usieciowaną postać keratyny 8 (przybliżona waga monomerów keratyny 8, 53 kd) stwierdzono u pacjentów z mutacją G61C, ale nie u tych z prawidłowymi próbkami wątroby lub innymi pacjentami z marskością wątroby (dane nie pokazany). Ta usieciowana postać zniknęła w warunkach redukujących. Intensywne pasmo przeciwciała (> 200 kD) w warunkach nieredukujących zniknęło w warunkach redukujących, zgodnie z oczekiwaniami, z powodu wytworzenia lekkich i ciężkich łańcuchów przeciwciała. Gwiazdki oznaczają zdegradowaną keratynę 8 i ciężki łańcuch przeciwciała. Read more „Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby ad 5”

Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby czesc 4

Test chi-kwadrat Pearsona23 zastosowano do porównania fenotypów filamentów transfekowanych komórek; 194 do 225 komórek na konstrukt zliczono w dwóch niezależnych eksperymentach. Wyniki
Identyfikacja mutacji w genie Keratin 8
Tabela 1. Tabela 1. Tło rasowe lub etniczne a płeć pacjentów. Uzupełniający dodatek 2. Read more „Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby czesc 4”

Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby cd

(Sekwencje starterów stosowanych w reakcji łańcuchowej polimerazy [PCR] są dostępne jako Dodatek Dodatek wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie http://www.nejm.org.) Analizowano produkty amplifikacji PCR (Mutation Detection) Żele wzmacniające z 5 procentowym glicerolem, FMC BioProducts, Rockland, Me.) I sekwencjonowane w razie potrzeby (sekwenser ABI 377, Applied Biosystems, Foster City, CA, i GeneScan Analysis Program, wersja 2.0.2, Applied Biosystems). Próbki genomowego DNA z wzorami przesunięcia według skanowania genowego zastosowano do wytworzenia 521-par zasad odpowiadających domenie głowy keratyny 8 w celu późniejszego sekwencjonowania i trawienia enzymem restrykcyjnym Ncol i EcoT22I. Metody biochemiczne
Próbki tkanek z eksplantowanych wątrób zostały homogenizowane w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem zawierającej 1% n-dodecylo-N, N-dimetyloglicyny (Empigen BB, Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA), EDTA (5 mmol na litr) i inhibitory proteazy . Próbki odwirowano przy 16 000 xg przez 30 minut, a sklarowany supernatant zastosowano do strącania 18. Immunoprecypitaty kompleksu keratynowego 8-keratyny 18 otrzymano z eksplantowanych wątrób z użyciem przeciwciała L2A116 anty-K8-K18, a następnie analizuje się jedną z następujących metod: denaturującą elektroforezę w żelu poliakryloamidowym w warunkach redukujących lub nieredukujących (tj. Read more „Mutacje keratyny 8 u pacjentów z kryptogenną chorobą wątroby cd”